薬学部 微生物学教室
Department of Microbiology
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■ 概要
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Micromonospora属放線菌の遺伝子組換えによる新規マクロライド抗生物質の創製
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16員環マクロライド抗生物質mycinamicin生合成のkey enzymeであるチトクロームP450酵素MycGをコードする遺伝子mycGの発現に関与するプロモーター領域mycGpについて解析を進めている。また、mycinamicin生産菌Micromonospora griseorubidaのゲノム解析から、本菌株は他の放線菌菌株と同様に50ほどのシグマ因子をコードする遺伝子をもつことが明らかとなった。現在、mycinamicin生合成遺伝子の発現調節に関わるシグマ因子のスクリーニングを行っている。
Micromonospora rosariaが生産する16員環マクロライド抗生物質rosamicinの生合成には2種類のチトクロームP450酵素RosC, RosDが関与している。特にRosCはrosamicinのラクトン環構造protorosanolideに対して3段階の酸化反応を行うユニークなP450酵素であり、現在、詳細な機能解析を進めている。
16員環マクロライド抗生物質izenamicin生産菌Micromonospora sp. FERM BP-1076にmycinose生合成遺伝子を導入したTPMA0041株の培養液にプロピオン酸を添加することで、高い抗菌活性をもつmycinosyl-izenamicin B2 (TMC-016)を生産する。プロピオン酸はラクトン環の前駆体であり、methylmalonyl-CoAを介してラクトン環に取り込まれる。methylmalonyl-CoAはType-I PKS内のアシルトランスフェラーゼ(AT)領域により取り込まれ、AT領域の基質特異性はmycinosyl-izenamicin B2の生産性に大きく影響を与える。現在、izenamicinおよびrosamicin生合成に関与するType-I PKS内のAT領域の比較を行っている。
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Quorum Sensing 阻害を指標とした生理活性物質のスクリーニング
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放線菌は、抗生物質、免疫抑制剤、抗がん剤をはじめとする様々な構造の、様々な生理活性を持つ二次代謝産物を生産する菌株が多数含まれる。近年、新規骨格をもつ放線菌由来の生理活性物質の報告が極度に減少していること、現在用いられている細菌感染症治療薬に対する耐性菌の蔓延から、抗菌活性を持つ物質では無く、細菌の病原性遺伝子の発現に関与する細菌細胞間の情報伝達機構、quorum sensingを阻害する代謝産物（QSI）生産菌のスクリーニングをおこなった。スクリーニングにはChromobacterium violaceum CV026を用い、グラム陰性細菌のQSI生産菌を分離した。それぞれの生産菌よりQSI活性を持つ物質を分離し構造決定を行った。いずれも既知物質であったが、Streptomyces sp. TOHO-Q003からクロラムフェニコール類似体であるDimethylamphenicolおよびcorynecinI、Streptomyces sp. TOHO-O443 よりAureothinおよびAlloaureothin、Streptomyces sp. TOHO-O348よりPiericidin A1及び3’-rhamnopiericidin A1がグラム陰性細菌のquorum sensing阻害物質として単離された。特に、AureothinおよびAlloaureothinは0.3〜10 µg/mLの濃度で阻害が認められることからseed化合物として有用と考えられる。
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雨水貯留槽中のミクロフローラとバイオフィルム
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世界の人口が急速に増加し、特に、アフリカやアジア諸国での人口の急増により、まもなく70億に達することが予測され、これらの地域では水の需要が増大することは必須であり、水不足の解消は全世界的な問題となっている。その一助として雨水を貯留し有効利用することが検討されている。公衆衛生上の観点から、雨水貯留槽中にはどのようなミクロフローラが形成されているのか、貯留槽に形成されるバイオフィルムと貯留水中の細菌の関連を明らかにするために検討を開始した。都内の雨水貯留槽から貯留水、壁に形成されたバイオフィルムをサンプリングし、浮遊細菌数、バイオフィルム中の生菌数、DGGE法を用いた16SrDNA配列の決定によりミクロフローラの解析を行った。また、実験室でバイオフィルム形成量と浮遊細菌数の関連を測定した結果、バイオフィルム量の増加とともに浮遊細菌数が減少する傾向が認められた。
バイオフィルム形成能の高い細菌BF2と緑膿菌、ネズミチフス菌を用いて、実験室でバイオフィルム形成に伴うこれらの病原性細菌の浮遊細菌数を調べた結果、浮遊細菌中の緑膿菌、ネズミチフス菌の細胞数はバイオフィルム量の増加に伴い減少し、バイオフィルム中の緑膿菌、ネズミチフス菌数の増加が認められた。これらの結果から、緑膿菌、ネズミチフス菌などの病原細菌による汚染があった場合でも、多くがバイオフィルムに吸着され、浮遊状態の細胞数は減少するものと推定される。更に、バイオフィルム形成を促進する物質について検討を行い、DMSOにバイオフィルム形成促進作用がある事が明らかとなった。
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放線菌のセシウム移送系に関する研究
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2011年の福島第一原子力発電所事故で放出された放射性Csによる環境汚染は東日本大震災により発生した多くの問題の中でも最も深刻な問題の１つである。放射性Csによる農作物等の汚染は、1986年のチェルノブイリ原子力発電所事故でも同様に確認され、特に野生キノコへの放射性Csの蓄積量は他の周辺植物と比べてより高い値であった。我々は土壌細菌である放線菌がキノコと同様に細胞内にCsを蓄積することを明らかにし、放線菌におけるCs蓄積経路を解明するためにKチャネル、K移送系のCs蓄積への影響を検討している。放線菌のモデル菌株の１つであるStreptomyces lividans TK24はK移送系としてTrk移送系、Kdp移送系、KチャネルとしてKcsAをコードする遺伝子、更にkcsAの類似配列をもつ遺伝子などを保持する。一方、キノコ生育土壌から分離した放線菌Streptomyces sp. K202のゲノム解析を行ったところ、Trk移送系、Kdp移送系の遺伝子は確認出来たが、Kチャネルをコードする遺伝子はkcsA2遺伝子のみであった。現在、S. lividans TK24およびStreptomyces sp. K202のK輸送に関わると推定される遺伝子の欠損株を作成し、それら変異株のCs蓄積への影響を検討している
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臨床分離緑膿菌のキノロン耐性に関する研究
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医療施設における院内感染症の原因菌として多剤耐性緑膿菌が問題となっている。特に緑膿菌感染症に汎用されてきたニューキノロン系抗菌薬シプロフロキサシンに耐性を持つ緑膿菌が問題となっている。緑膿菌臨床分離株約300株についてシプロフロキサシン、パズフロキサシン、アミカシン、メロペネムにたいする感受性を測定した。入院患者由来の緑膿菌株では多くのキノロン耐性株が存在することを確認した。PCRにより耐性株のgyrA, parCを増幅し、その塩基配列を決定した結果、耐性株の多くがgyrAだけ、またはgyrAとparCにアミノ酸置換を伴う変異を持つことが明らかとなった。更に、高度耐性株では、排出ポンプの調節遺伝子にも変異が認められ、複数の変異の重なりが高度な耐性を持つことが明らかになった。分離した高度耐性株はキノロン系薬剤以外の薬剤に対する耐性も同時に獲得している。臨床分離株の薬剤耐性にかかわる進化について検討するため同一患者由来の22株を用いて検討した。ERIC PCR及びシカジーニアスキットを用いた解析の結果、22株中21位株が同一菌株であると推定された。 この結果から、hypermutableな株である最初の分離株が様々な薬剤にさらされた結果、種々の薬剤に対する耐性を獲得した株が生き残っていたものと推定した。種々の感染症治療薬の投与された患者より分離された緑膿菌株の多くは、治療日数の増加とともに複数の薬剤に対する耐性を示す菌株の比率が増加しており、これらの多剤耐性緑膿菌のシプロフロキサシンやメロペネム耐性獲得にはhyper-mutabilityが関与していることを示唆する結果を得た。
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■ Keywords
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放線菌, マクロライド, Micromonospora, セシウム, カリウム移送系, バイオフィルム, quorum sensing, Pseudomonas aeruginosa, 多剤耐性
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■ 当該年度の研究費受入状況
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1.
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（公財）平和中島財団 2013(平成25)年度 アジア地域重点学術研究助成
研究課題：モンゴル原産植物及び微生物からの有用生物活性物質の探索
(研究代表者：安齊洋次郎)
研究補助金：1500000円 (代表)
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■ 教授・准教授・講師の学会・研究会の役員
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1.
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加藤文男
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：日本放線菌学会 理事
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2.
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安齊洋次郎
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：日本放線菌学会 学術企画委員
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■ 当該年度研究業績数一覧表
| 研究者名 |
刊行論文 |
著書 |
その他 |
学会発表 |
その他
発表 |
| 和文 | 英文 |
和文 | 英文 |
国内 | 国際 |
筆
頭 | 共
著 | 筆
頭 | 共
著 |
筆
頭 | 共
著 | 筆
頭 | 共
著 |
筆
頭 | 共
著 |
演
者 | 共
演 | 演
者 | 共
演 |
演
者 | 共
演 |
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加藤 文男
教授
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| | | 4 |
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5
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安齊 洋次郎
准教授
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| | | 4 |
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|
5
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福本 敦
助教
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| | | 1 |
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2
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3
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| 計 |
0 | ／ | 0 | ／ |
0 | ／ | 0 | ／ |
0 | ／ |
2
(0) | ／ |
0
(0) | ／ |
0
(0) | ／ |
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| 研究者名 |
刊行論文 |
著書 |
その他 |
学会発表 |
その他
発表 |
和
文 | 英
文 |
和
文 | 英
文 |
国
内 | 国
際 |
筆
頭 | 筆
頭
| 筆
頭 | 筆
頭
| 筆
頭 |
演
者 | 演
者
| 演
者 |
|
加藤 文男
教授
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| |
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安齊 洋次郎
准教授
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福本 敦
助教
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|
2
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| 計 |
0 | 0 |
0 | 0 |
0 |
2
(0) |
0
(0) |
0
(0) |
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( )：発表数中の特別講演、招請講演、宿題報告、会長講演、基調講演、受賞講演、教育講演(セミナー、レクチャーを含む)、シンポジウム、パネル(ラウンドテーブル)ディスカッション、ワークショップ、公開講座、講習会
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( )：発表数中の特別講演、招請講演、宿題報告、会長講演、基調講演、受賞講演、教育講演(セミナー、レクチャーを含む)、シンポジウム、パネル(ラウンドテーブル)ディスカッション、ワークショップ、公開講座、講習会
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■ 刊行論文
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原著
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1.
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Zhang W, Liu Y, Yan J, Cao S, Bai F, Yang Y, Huang S, Yao L, Anzai Y†, Kato F†, Podust LM, Sherman DH, Li S：
New reactions and products resulting from alternative interactions between the P450 enzyme and redox partners.
Journal of the American Chemical Society
136
(9)
：3640
-3646
, 2014
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2.
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Kobayashi H, Isozaki M, Fukuda T, Anzai Y†, Kato F＊†：
Surveillance of Fluoroquinolone-Resistant Clinical Isolates of Pseudomonas aeruginosa.
Open Journal of Medical Microbiology
3
(2)
：144
-150
, 2013
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3.
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Ooka K, Fukumoto A†, Yamanaka T, Shimada Y, Ishihara R, Anzai Y†, Kato F＊†：
Piericidins, novel quorum-sensing inhibitors against Chromobacterium violaceum CV026, from Streptomyces sp. TOHO-Y209 and TOHO-O348.
Open Journal of Medicinal Chemistry
3
(4)
：93
-99
, 2013
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4.
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Hong Bai, Wei Li＊†, Huanxin Zhao, Yojiro Anzai†, Haiming Li, Huanjie Guo, Fumio Kato†, Kazuo Koike†：
Isolation and structural elucidation of novel cholestane glycosides and spirostane saponins from Polygonatum odoratum.
Steroids
80
：7
-14
, 2014
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■ 学会発表
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国内学会
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1.
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Suwdaa TSENGUUMAA, ◎福本敦†, 安齊洋次郎†, Javzan BATKHOO, 加藤文男†：
放線菌が産生するquorum sensing阻害物質のスクリーニングについて.
日本薬学会 第134年会,
熊本,
2014/03
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2.
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◎稲坂翔麻, 安齊洋次郎†, 福本敦†, 加藤文男†：
マイシナミシン生産菌Micromonospora griseorubida A11725の置換型シグマ因子の機能解析.
日本薬学会 第134年会,
熊本,
2014/03
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3.
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◎堀越晨裕†,安齊洋次郎†,福本敦†,加藤文男†：
放線菌Streptomyces lividans TK24のK+ チャネルKcsA , KcsA2によるCs+ 取り込みについて.
日本薬学会 第134年会,
熊本,
2014/03
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4.
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◎飯坂洋平, 東徳子, 福本敦†, 安齊洋次郎†, 加藤文男†：
Micromonospora rosariaのrosC、rosD欠損変異株へのmycinose生合成遺伝子導入による新規mycinosyl rosamicin誘導体の生産.
第28回 日本放線菌学会大会,
広島,
2013/09
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5.
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◎福本敦†, 山中智恵, 大岡和広, 安齊洋次郎†, 加藤文男†：
放線菌の生産するQuorum sensing阻害新規化合物について.
第28回 日本放線菌学会大会,
広島,
2013/09
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