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 薬学部 微生物学教室
 Department of Microbiology

教授:
  加藤 文男
准教授:
  安齊 洋次郎
■ 概要
Micromonospora属放線菌の遺伝子操作による新規マクロライド抗生物質の創製
16員環マクロライド抗生物質mycinamicin生合成のkey enzymeであるチトクロームP450酵素MycGをコードする遺伝子mycGの発現に関与するであろうプロモーター領域myrBp, mycGpについて解析を進めている。mycGの欠失変異株を用いた解析では、両プロモーター領域のそれぞれがmycGの発現に関与できることを明らかにした。また、mycinamicin生産菌Micromonospora griseorubidaのゲノム解析によりドラフト配列を取得した。本菌株は他の放線菌菌株と同様に50ほどのシグマ因子をコードする遺伝子を持っていた。現在、mycinamicin生合成遺伝子の発現調節に関わるシグマ因子のスクリーニングを行っている。
16員環マクロライド抗生物質rosamicinの生合成には2種類のチトクロームP450酵素RosC, RosDが関与している。これらP450酵素を大腸菌細胞内で発現させ、in vitroでのrosamicin生合成中間体の酸化反応を確認した。また、rosC, rosD遺伝子の欠失変異株にmycinose生合成遺伝子を導入した菌株は新規mycinosyl-rosamicinを生産した。
16員環マクロライド抗生物質izenamicin生産菌Micromonospora sp. FERM BP-1076にmycinose生合成遺伝子を導入したTPMA0041株の培養液にプロピオン酸を添加することで、高い抗菌活性をもつmycinosyl-izenamicin B2 (TMC-016)を生産する。プロピオン酸はマクロライドラクトン環の前駆体であり、methylmalonyl-CoAを介してラクトン環に取り込まれる。methylmalonyl-CoAはType-I PKS内のアシルトランスフェラーゼ(AT)領域により取り込まれるが、その基質特異性は個々のAT領域によって異なる。現在、izenamicinおよびrosamicin生合成に関与するType-I PKS内のAT領域の比較を行っている。
Quorum Sensing 阻害を指標とした生理活性物質のスクリーニング
放線菌と呼ばれる土壌細菌には、抗生物質、免疫抑制剤、抗がん剤をはじめとする様々な構造の、様々な生理活性を持つ二次代謝産物を生産する菌株が多数含まれる。近年、新規骨格をもつ放線菌由来の生理活性物質の報告が極度に減少している。新たな有用生理活性物質生産菌の分離を目的として、病原性遺伝子の発現に関与する細菌細胞間の情報伝達機構、quorum sensingを阻害する代謝産物生産菌の分離を行った。
Chromobacterium violaceumCV026を用いた、グラム陰性細菌のquorum sensing阻害物質生産菌のスクリーニングを行った。前年度分離し、構造決定したSW-6についで、Streptomyces sp. TOHO420より新たなquorum sensing阻害物質を単離精製し構造を決定した。
雨水貯留槽中のミクロフローラとバイオフィルム
世界の人口が急速に増加し、特に、アフリカやアジア諸国での人口の急増により、まもなく70億に達することが予測され、これらの地域では水の需要が増大することは必須であり、水不足の解消は全世界的な問題となっている。その一助として雨水を貯留し有効利用することが検討されている。公衆衛生上の観点から、雨水貯留槽中にはどのようなミクロフローラが形成されているのか、貯留槽に形成されるバイオフィルムと貯留水中の細菌の関連を明らかにするために検討を開始した。都内の雨水貯留槽から貯留水、壁に形成されたバイオフィルムをサンプリングし、浮遊細菌数、バイオフィルム中の生菌数、DGGE法を用いた16SrDNA配列の決定によりミクロフローラの解析を行った。また、実験室でバイオフィルム形成量と浮遊細菌数の関連を測定した結果、バイオフィルム量の増加とともに浮遊細菌数が減少する傾向が認められた。
前年度分離したバイオフィルム形成能の高い細菌BF2と緑膿菌を用いて、実験室でバイオフィルム形成に伴う浮遊細菌数の減少を調べた結果、浮遊細菌中の緑膿菌数はバイオフィルム量の増加に伴い減少し、バイオフィルム中の緑膿菌数の増加が認められた。また、バイオフィルム形成を促進する低分子物質についても検討を行い、ある金属イオンにバイオフィルム形成促進効果がある事を明らかにした。
放線菌のセシウム移送系に関する研究
Streptomyces lividans TK24を用いてCs蓄積経路を明らかにするためにKチャネル、K移送系のCs蓄積への影響を検討している。Streptomyces lividans TK24の染色体DNAに存在する大腸菌のK移送系trkAに類似した配列が、K移送に関わる遺伝子であることを遺伝子破壊、破壊株の相補により明らかにした。大腸菌のTrkAと比較してS. lividansには分子量が約1/2のTrkA1およびTrkA2タンパク質をコードする遺伝子trkA1,trkA2が存在した。これらのタンパク質がどのように機能するかを明らかにするために、trkA変異株Escherichia coliME5443を用いて検討を行った。trkA1,trkA2およびtrkA1trkA2を大腸菌発現ベクターpET28aにクローニングし、ME5443に導入した。K濃度の異なる最少培地でそれぞれの導入株の増殖を比較したところ、trkA1trkA2を導入した株が最も増殖がよく、次いでtrkA2導入株で、trkA1導入株では増殖が認められなかった。この結果から、グラム陽性細菌であるS. lividans のtrkAがグラム陰性細菌であるE. colitrkA変異を相補すること、また、E. coliのTrkAと同等の機能を発揮するためにはTrkA1とTrkA2が共存することが必要であることを明らかにした。
 現在までにS. lividansのKチャネル(KcsA)、Trk移送系、Kdp移送系の破壊株を作成し、破壊株のCs蓄積への影響を調べたが顕著な増減は認められないことから、未知のイオンチャネル、移送系のCs蓄積への関与を推定し未知のイオンチャネル、移送系の検索を行っている。
臨床分離緑膿菌のキノロン耐性に関する研究
医療施設における院内感染症の原因菌として多剤耐性緑膿菌が問題となっている。特に緑膿菌感染症に汎用されてきたニューキノロン系抗菌薬シプロフロキサシンに耐性を持つ緑膿菌が問題となっている。
緑膿菌臨床分離株約300株についてシプロフロキサシン、パズフロキサシン、アミカシン、メロペネムにたいする感受性を測定した。入院患者由来の緑膿菌株では多くのキノロン耐性株が存在すること、PCRにより耐性株のgyrA, parCを増幅し、その塩基配列を決定した結果、耐性株の多くがgyrAだけ、またはgyrAparCにアミノ酸置換を伴う変異を持つことが明らかとなった。更に、高度耐性株では、排出ポンプの調節遺伝子にも変異が認められた。複数の変異が重なることによりより高度な耐性を持つことが明らかになった。
■ Keywords
放線菌, マクロライド, Micromonospora, セシウム, カリウム移送系, バイオフィルム, quorum sensing, 緑膿菌
■ 当該年度の研究費受入状況
その他
1.  東邦大学薬学部奨励研究
 研究課題:放線菌の二次代謝産物生合成遺伝子発現に関与する置換型シグマ因子の網羅的解析  (研究代表者:安齊洋次郎)
 研究補助金:500000円  (代表)
■ 教授・准教授・講師の公的役職
1.  加藤 文男 :日本薬学会関東支部 幹事, 千葉県製薬協会 理事
■ 教授・准教授・講師の学会・研究会の役員
1.  加藤 文男 :日本放線菌学会 副会長
2.  安齊洋次郎 :日本放線菌学会 学術企画委員
■ 当該年度研究業績数一覧表
研究者名 刊行論文 著書 その他 学会発表 その他
発表
和文英文 和文英文 国内国際
















加藤 文男   教授
薬学博士
    1          
 9
 
 2
 
 
安齊 洋次郎   准教授
博士(農学)
    2          1
 8
 1
 1
 
 
入江 庸公   助教
薬学士
              
 1
 
 
 
 
 0 0  0 0  0  1
(0)
 1
(0)
 0
(0)
研究者名 刊行論文 著書 その他 学会発表 その他
発表














加藤 文男   教授
薬学博士
         
 
 
安齊 洋次郎   准教授
博士(農学)
         1
 1
 
入江 庸公   助教
薬学士
         
 
 
 0 0  0 0  0  1
(0)
 1
(0)
 0
(0)
(  ):発表数中の特別講演、招請講演、宿題報告、会長講演、基調講演、受賞講演、教育講演(セミナー、レクチャーを含む)、シンポジウム、パネル(ラウンドテーブル)ディスカッション、ワークショップ、公開講座、講習会 (  ):発表数中の特別講演、招請講演、宿題報告、会長講演、基調講演、受賞講演、教育講演(セミナー、レクチャーを含む)、シンポジウム、パネル(ラウンドテーブル)ディスカッション、ワークショップ、公開講座、講習会
■ 刊行論文
原著
1. Akey DL, Li S, Konwerski JR, Confer LA, Bernard SM, Anzai Y, Kato F, Sherman DH, Smith JL:  A new structural form in the SAM/metal-dependent O-methyltransferase family: MycE from the mycinamycin biosynthetic pathway.  Journal of molecular biology  413 (2) :438-450 , 2011
2. Carlson JC, Li S, Gunatilleke SS, Anzai Y, Burr DA, Podust LM, Sherman DH:  Tirandamycin biosynthesis is mediated by co-dependent oxidative enzymes.  Nature Chemistry  3 (8) :628-633 , 2011
■ 学会発表
国内学会
1. ◎小林秀樹, 真坂亙, 加藤裕芳, 浅山亨, 入江庸公, 安齊洋次郎, 加藤文男: 緑膿菌臨床分離株のニューキノロン耐性に関する研究.  日本薬学会 第132年会,  札幌,  2012/03
2. ◎桑原千雅子, 安齊洋次郎, 加藤文男: 土壌微生物によるセシウム蓄積.  第51回 日本放線菌学会 講演会,  東京,  2012/02
3. ◎神子克之, 砂田真希, 大島亜希子, 城戸口桃子, 安野菜摘, 安齊洋次郎, 村瀬誠, 加藤文男: 雨水貯留槽の細菌学的検討.  第55回日本薬学会関東支部大会,  船橋,  2011/10
4. ◎本村加織, 杉紗也子, 匡薪竹, 李魏, 山崎貴人, 大岡和宏, 小池一男, 安齊洋次郎, 加藤文男: 放線菌の産生する quorum sensing 阻害物質について.  第55回日本薬学会関東支部大会,  船橋,  2011/10
5. 安齊洋次郎, ◎増田怜平, 百目鬼彩加, 木下健司, 加藤文男: 16員環マクロライド抗生物質 mycinamicin 生合成遺伝子の発現機構.  第55回日本薬学会関東支部大会,  船橋,  2011/10
6. 諏訪友里加, ◎鈴木晶子, 盛川敬介, 椎野佑麻, 金子憲太郎, 桑原千雅子, 安齊洋次郎, 杉山英男, 加藤文男Streptomyces lividans TK24 のK輸送系について.  第55回日本薬学会関東支部大会,  船橋,  2011/10
7. 飯坂洋平, 東徳子, ◎石田雅也, 大岩礼奈, 市河由美, 武田萌加, 李巍, 安齊洋次郎, 加藤文男: 16員環マクロライド抗生物質rosamicin生合成経路の解析.  第55回日本薬学会関東支部大会,  船橋,  2011/10
8. ◎安齊洋次郎, 塚田秀一, 酒井彩美, 増田怜平, 百目鬼彩加, 木下健司, 加藤文男: Mycinamicin生産菌Micromonospora griseorubidaにおけるcytochrome P450酵素MycGの多機能性.  日本薬学会 第132年会,  札幌,  2012/03
9. 酒井彩美, ◎三森暁, 會田香緒里, 李巍, 安齊洋次郎, 加藤文男: Mycinamicin生合成遺伝子を用いた有用生理活性物質の生産.  第55回日本薬学会関東支部大会,  船橋,  2011/10
国際学会
1. ◎Anzai Y, Tsukada S, Li S, Kinoshita K, Sherman DH, Kato F: Targeting for O-methyltransferase gene, mycF, and cytochrome P450 enzyme gene, mycG, on the chromosome of Micromonospora griseorubida producing mycinamicin with disruption cassette containing bacteriophage phiC31 attB attachment site.  16th International Symposium on the Biology of Actinomycetes (ISBA16),  Puerto Vallarta, Mexico,  2011/12
2. Anzai Y, ◎Iizaka Y, Higashi N, Kato F: Function of cytochrome P450 genes, rosC and rosD, in biosynthesis of rosamicin macrolide antibiotics.  International Union of Microbiological Societies 2011 Congress (IUMS2011),  Sapporo, Japan,  2011/09
  :Corresponding Author
  :本学研究者